(fot. K. Buczkowska)

Kierownik projektu prof. dr hab. Wiesław Wasiak

Projekt finansowany przez Narodowe Centrum Nauki na podstawie umowy UMO 2013/09/B/NZ8/03274

Cel naukowy projektu

Aneura pinguis (L.) Dumort. to plechowaty wątrobowiec o szerokim zasięgu geograficznym. Na całym obszarze występowania, do lat 70-tych gatunek ten powszechnie był uważany za morfologicznie jednorodny.

Rys. 1. Aneura pinguis (fot. K. Buczkowska)

Wraz z wprowadzeniem do taksonomii mszaków metod biochemicznych wykryto w obrębie tego taksonu gatunki kryptyczne. Gatunki kryptyczne charakteryzują się całkowitym lub prawie całkowitym brakiem różnic morfologicznych przy izolacji reprodukcyjnej i odrębnej puli genowej. Odległości genetyczne Nei’a pomiędzy gatunkami kryptycznymi wyróżnionymi w obrębie A. pinguis wynoszą średnio DN = 1.058  i są wyższe niż pomiędzy uznanymi taksonomicznie gatunkami należącymi do jednego rodzaju u roślin wyższych DN = 0.400, to świadczy, że zróżnicowane genetyczne A. pinguis jest na poziomie gatunkowym. Do tej pory udowodniono istnienie przynajmniej pięciu gatunków kryptycznych u A. pinguis A, B, C, D, E. Ostatnie badania genetyczne ujawniły obecność kolejnego gatunku krytycznego A. pinguis - F. Na terenie Polski gatunki te wykazują pewne zróżnicowanie geograficzne - gatunki A, E i F występują głównie w górach (Tatry, Pieniny), gatunek B jest charakterystyczny dla Bieszczadów, rzadziej spotykany jest w północnej Polsce (Pomorze, Białowieża), gatunek C występuje głównie na Pomorzu na brzegach jezior oligotroficznych. Badania genetyczne, oraz kompleksowa analiza biometryczna i analiza ciał oleistych wykazały drobne różnice na poziomie morfologicznym pomiędzy gatunkami A, B i C. Jednak zróżnicowanie morfologiczne jest niewielkie dlatego prawidłowe oznaczenie poszczególnych gatunków bez użycia metod genetycznych jest niezwykle trudne. Jedną z metod molekularnych służących do identyfikacji szczególnie trudnych taksonomicznie gatunków jest wykorzystanie sekwencji DNA. Diagnostyczne sekwencje DNA zostały znalezione także dla gatunków kryptycznych A. pinguis.

Wątrobowce, w tym również A. pinguis, charakteryzują się obecnością ciał oleistych w komórkach, w których gromadzą się lotne związki należące głównie do grupy terpenoidów. Przeprowadzone wstępne badania wykazały znaczące różnice w składzie związków pomiędzy poszczególnymi gatunkami kryptycznymi A. pinguis.

A	B
C	D

Rys. 2. Ciała oleiste A. pinguis: A – gatunek A; B – gatunek B; C – gatunek C; D – gatunek F (fot. K. Buczkowska).

Celem naukowym projektu jest określenie składu ilościowego i jakościowego lotnych związków zawartych w komórkach wymienionych gatunków wątrobowców. Nowo odkryte związki zostaną scharakteryzowane za pomocą metod fizykochemicznych. Dla każdego z gatunków zostanie sporządzona mapa związków-markerów niezbędna do przeprowadzenia identyfikacji gatunkowej na podstawie składu chemicznego. Ze względu na złożoność składu analizowanych związków w badanym materiale, badania w ramach projektu postanowiono ograniczyć do gatunków o uboższym składzie (40-50 związków) tj. do nieopisanego dotychczas nowego gatunku kryptycznego Aneura piguis F oraz wcześniej wykrytych gatunków Aneura piguis B i C.

Koncepcja i plan zadań

Identyfikacja składu jakościowego i ilościowego związków obecnych w wytypowanych do badań wątrobowcach Aneura pinguis zostanie przeprowadzona w dwóch etapach na roślinach oznaczonych genetycznie w oparciu o markerowe sekwencje DNA:

- Pierwszy etap badań będzie obejmował analizę składu w oparciu o mikroekstrakcję lotnych związków do fazy stacjonarnej (SPME). Separacja związków zostanie przeprowadzona na chromatografie gazowym. Identyfikacja związków zostanie przeprowadzona w oparciu o analizę widm masowych i ich porównanie z widmami dostępnych związków wzorcowych.

- Drugi etap badań będzie obejmował wyodrębnienie z materiału biologicznego oraz oczyszczenie tych związków, dla których nie udało się przeprowadzić identyfikacji na podstawie analizy widm masowych (brak dostępności substancji wzorcowych). Wyizolowane związki zostaną scharakteryzowane za pomocą klasycznych metod instrumentalnych i widm NMR.

Wyniki prowadzonych badań

Publikacje:

• Wawrzyniak, R., Wasiak, W., Bączkiewicz, A., Buczkowska, K., 2014. Volatile compounds in cryptic species of the Aneura pinguis complex and Aneura maxima (Marchantiophyta, Metzgeriidae). Phytochemistry 105, 115-122. View Article
• Bączkiewicz, A., Szczecińska M., Sawicki J., Stebel A., Buczkowska, K., 2017. DNA barcoding, ecology and geography of the cryptic speciesof Aneura pinguis and their relationships with Aneura maxima and Aneura mirabilis (Metzgeriales, Marchantiophyta). PLoS ONE 12(12): e0188837. View Article
• Wawrzyniak, R., Wasiak, W., Jasiewicz, B., Ludwiczuk, A., Bączkiewicz, A., Buczkowska, K., 2018. High correlation of chemical composition with genotype in cryptic species of the liverwort Aneura pinguis. Phytochemistry 152, 134-147. View Article

Wybrane materiały pokonferencyjne:

• R. Wawrzyniak, W. Wasiak, A. Bączkiewicz, J. Ostrowska "Determination of volatile compounds in the liverwort Aneura pinguis by the GC-HS-SPME technique";Proceedings 40 International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranske Matliare, Slovakia, May 27-31, 2013
• R. Wawrzyniak, W. Wasiak, K. Buczkowska, J. Ostrowska "Characteristics of Volatile Compounds in the Liverwort Aneura pinguis Collected in the Poland" 19th International Symposium on Separation Sciences, New Achievements In Chromatography, Poreč, Croatia 25-28 September, 2013
• R. Wawrzyniak, W. Wasiak, K. Buczkowska, A. Bączkiewicz "The Aneura pinguis cryptic species A as natural source of terpenoids" Proceedings 41 International Conference of Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranske Matliare, Slovakia, May 26-30, 2014
• R. Wawrzyniak, W. Wasiak, A. Bączkiewicz, K. Buczkowska "Differences in composition of volatile compounds in cryptic species a of the Aneura pinguis complex (Marchantiophyta, Metzgeriidae)" 9th International Symposium on Chromatography of Natural Products, 26-29 May, 2014 Lublin, Poland.
• R. Wawrzyniak, W. Wasiak, B. Jasiewicz, A. Bączkiewicz, K. Buczkowska "Differences in composition of volatile compounds in cryptic species B of the Aneura pinguis complex (Marchantiophyta, Metzgeriidae)" 46th International Symposium On Essential Oils, 13-16 September 2015, Lublin
• R. Wawrzyniak, W. Wasiak, B. Jasiewicz, A. Bączkiewicz, K. Buczkowska „Composition of volatile compounds in cryptic species e of the Aneura pinguis complex (Marchantiophyta, Metzgeriidae)” 43rd International Conference of SSCHE, May 23–27, 2016, Tatranské Matliare, Slovakia